基因步移（genomic walking）實(shí)驗(yàn)

基步移(genomic walking)實(shí)驗(yàn)用以鑒定已經(jīng)克隆的特定DNA片段側(cè)翼順序的方法。肥經(jīng)被鑒腚
的特定DNA片段一端或兩端的末端片段為探針去篩選基因組DNA文庫(kù), DNA-端或兩端并與之重疊的克隆
進(jìn)行篩選與定。然后用新鑒定克隆中與原始克隆DNA非共有的一端的片股作探針，進(jìn)行新的篩選與鑒
定。依次類推，可以弄清跨度為幾百個(gè)kb的連接片段。基銦組步移分為基因組結(jié)合文庫(kù)的染色體步移技術(shù)
和基于PCR擴(kuò)增的技術(shù)。

TAIL-PCR法可用于基因步移研究。該技術(shù)通過(guò)3個(gè)嵌套的特異性弓|物分別和簡(jiǎn)并弓|物組合進(jìn)行連續(xù)的
PCR循環(huán)，利用不同的退火溫度選擇性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)片段,所獲得的片段可以直接用做探針標(biāo)記和測(cè)序模
板。該技術(shù)省去了諸如:酶切、連接、加尾等傳統(tǒng)的基因克隆步驟,且克服了常規(guī)PCR不能對(duì)已知DNA
列側(cè)翼的位置序列進(jìn)行擴(kuò)增的缺點(diǎn)，能快速地分離到目標(biāo)序列。具有:操作簡(jiǎn)便成本低、高特異
性、高靈敏性、快速等優(yōu)點(diǎn)。
TAIL-PCR一般分為三輪PCR反應(yīng)。第一輪PCR反應(yīng) (如圖1) 由伍次高退火溫度(一 般65°C)的特異
性反應(yīng)、-次極低退火溫度(一 般25°C)的低特異性反應(yīng)，與由二個(gè)腿火溫度(一 般65°C)的高特異性
反應(yīng)與一個(gè)低退火溫度(一 般44°C) 的低特異性反應(yīng)所組成的15個(gè)熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)構(gòu)成。通過(guò)五次高
特異性的反應(yīng)，使spI與已知的序列(載體或T-DNA等)退火并延伸,提高目標(biāo)序列的濃度。一次低特異性的
反應(yīng)使簡(jiǎn)粥|物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上，隨后進(jìn)行15次熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)。經(jīng)過(guò)上述反應(yīng)得到了不同
濃度的三種類型的產(chǎn)物:由特異性弓|物和簡(jiǎn)并弓|物擴(kuò)增出的特異性產(chǎn)物和由同一簡(jiǎn)并引|物或特異引|物擴(kuò)增
得到的非特異性產(chǎn)物。第二輪PCR反應(yīng)(如圖2)則將第一級(jí)反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋1000倍作為模板，通過(guò)15次
熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)，使特異性的產(chǎn)物被選擇性地?cái)U(kuò)增,腓特異性的產(chǎn)物被壓制到極低的含量。第三輪
PCR反應(yīng)(如圖3) 又將第二輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋1000倍作為模板，-般設(shè)置為普通的PCR反應(yīng)或熱不
對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)。通過(guò)上述三輪PCR反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列。