如何對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行表達(dá)與復(fù)性

在平板上挑取單菌落，接種于含有氨芐青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到100 ml LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至A600 為0.4~0.6時(shí)，加入IPTG 至終濃度為0.5mmol/L 誘導(dǎo)3.5 h。8000 r/min 離心5 min 收集菌體，加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl，冰浴下超聲波破碎后12000 r/min離心30 min收集沉淀。

二、包涵體的洗滌
在包涵體中加入包涵體洗滌液：50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，w=0.5％TritonX-100，pH 8.0；37℃振蕩洗滌1～2 h，然后8 000 r/min 離心15 min，收集沉淀。

三、包涵體的溶解
洗滌后的包涵體加入適量的(包涵體溶解液)：6 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L  EDTA，50mmol/L NaCl，10 mmol/L β-ME，pH 8.0(注：β-ME用時(shí)現(xiàn)加)，于磁力攪拌器上攪拌過夜，1000  r/min離心30 min，取上清即得包涵體溶解液。

四、包涵體的復(fù)性
包涵體的復(fù)性目前常用的主要有兩種方式：1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋；2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑。

1.包涵體的稀釋復(fù)性
設(shè)定不同的復(fù)性條件：蛋白質(zhì)量濃度、尿素濃度、溫度、氧化還原條件、加入Ttiton X-100與環(huán)糊精的量、復(fù)性時(shí)間等，使變性溶解的包涵體稀釋復(fù)性，復(fù)性一定時(shí)間后取樣測(cè)酶活性。

2.包涵體的透析復(fù)性
包涵體蛋白的復(fù)性將8 mol/L 尿素溶解后的樣品裝入透析袋，密封置于復(fù)性液I（0.2 mol/L Tris-HCl；0.5 mol/L NaCl；5%甘油；5 μmol/L EDTA；pH8.5），4 ℃ 透析12 h 后再轉(zhuǎn)入復(fù)性液II（0.2 mol/L Tris-HCl；0.5 mol/L NaCl；）4 ℃ 透析12 h，12000 r/min 離心30 min，收集上清進(jìn)行蛋白濃度及活性測(cè)定。