單抗制備的生產(chǎn)及純化方法

　　抗體是機體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的，因而抗血清通常含有針對其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。一般的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇，所以常規(guī)抗體也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對同一抗原決定簇的常規(guī)血清抗體，仍是由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。
 

　　單抗制備的生產(chǎn)及純化方法：
 

　　(1)動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗
 

　　①成年BALB/c小鼠腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.3-0.5ml。
 

　　②7-10天后腹腔接種用PBS或無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠5×105/0.2ml。
 

　?、坶g隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可采集腹水。通常每只小鼠可采3ml腹水。
 

　?、軐⒏顾x心(2000r/min5分鐘)，除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，70℃凍存?zhèn)溆谩?br /> 

　　(2)單克隆抗體的純化(辛酸-硫酸銨沉淀法)
 

　?、俑顾?℃12000rpm離心15min，去除雜質(zhì)。
 

　?、谌?份腹水加2份0.06mol/LPH5.0醋酸緩沖液，按每毫升稀釋腹水加33ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，室溫混合30min。
 

　?、?℃靜置2小時，取出12000g離心30分鐘，棄沉淀。
 

　　④上清經(jīng)尼龍篩過濾，于50倍體積的0.01MPH7.4PBS中4℃透析6h。
 

　　⑤在透析后的上清中加入等體積飽和硫酸銨溶液。
 

　?、?℃靜置1h以上，10000g離心30分鐘，棄上清。
 

　　⑦沉淀溶于適量PBS(含137mmol/LNaCl，2.6mol/LKCl，0.2mmol/L EDTA)中，于50-100倍體積的PBS中透析過夜。
 

　　⑧取少量透析后樣品適當(dāng)稀釋后，以紫外分光光度計檢測蛋白含量，SDS-PAGE，抗體純度。