蛋白表達(dá)實驗過程可能遇到的常見問題分析

　　一、蛋白不表達(dá)或表達(dá)量很低？

　　1.選擇正確的表達(dá)載體和表達(dá)菌株

　　T7啟動子的載體應(yīng)選用BL21（DE3），BL21（DE3）pLysS，Transetta（DE3）等菌株。非T7啟動子的表達(dá)載體應(yīng)選用BL21表達(dá)菌株。

　　2.嘗試不同的表達(dá)載體與菌株

　　不同的蛋白，對不同載體與菌株的偏好不同，如果某一表達(dá)蛋白無法通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件得到明顯改善，可以更換其他菌株或表達(dá)載體。

　　3.表達(dá)條件的優(yōu)化

　　選擇不同的培養(yǎng)基。對于某些蛋白，在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖（0.1%-0.5%），可以明顯提高表達(dá)量。

　　較高的溫度、較高的誘導(dǎo)物濃度、較長的表達(dá)時間，一般可以加快表達(dá)的速度，促進(jìn)目的蛋白的積累，從而提高表達(dá)量。但可能會降低可溶蛋白的表達(dá)量，形成包涵體。

　　細(xì)胞的生長狀態(tài)對蛋白表達(dá)有很大的影響，可以通過測量菌液的OD600值監(jiān)測生長狀態(tài)。對于大部分蛋白，應(yīng)在菌株的對數(shù)生長期（OD600=0.5）進(jìn)行誘導(dǎo)。

　　二、目的蛋白大小不正確？

　　蛋白的結(jié)構(gòu)對判斷分子量大小有一定影響。可以通過加熱變性蛋白，從而準(zhǔn)確判斷蛋白大小。確認(rèn)蛋白表達(dá)是否完整，蛋白是否提前終止表達(dá)。若形成二聚體甚至多聚體，可以通過加熱變性蛋白打開二硫鍵（加入DTT、β-ME等還原劑）等手段，破壞次級結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確判斷分子量大小。