抗痩素納米抗體制備及篩選

　　瘦素是一種與能量代謝、免疫、生殖等相關的多功能細胞因子，其在血液中的含量異常會導致肥胖、營養不良、心血管疾病、腫瘤、肝病等多種疾病，特別是終末期腎衰患者廣泛存在瘦素水平過高的問題，由此導致腎衰癥患者營養不良、高血壓、胰島素抵抗等并發癥，這些并發癥嚴重影響了患者的生活質量，因此開發特異性抗體實現瘦素水平的檢測與去除將具有非常重要的臨床意義。納米抗體由于其諸多優良特點，成為該方面研究的選擇。獲得足夠量的抗原是進行抗體篩選的前提，由于血液中瘦素含量較低，進行了瘦素的制備，然后進行抗體的篩選。研究內容如下：

　　（1）瘦素制備。根據人瘦素氨基酸序列，構建了原核表達載體pET23a-leptin，優化后的表達條件：活化的菌體以1%轉接到新鮮培養基后，恒溫搖床37℃連續培養8h，期間不加入IPTG。瘦素以包涵體形式存在于大腸桿菌中，通過包涵體的洗滌、溶解、復性、強陰離子交換色譜，獲得純度95%的重組人瘦素蛋白。

　　（2）納米抗體篩選。通過五輪篩選，從瘦素免疫噬菌體庫和非免疫庫中分別得到18種和5種特異性納米抗體序列，因有一序列重復，得到22種。經Elisa方法檢測，選取其中結合活性較高的6種進行后續表達純化。

　　（3）納米抗體表達。利用PCR、雙酶切等手段構建6種納米抗體的表達載體，轉入宿主菌E.coli Shuffle T7進行表達。除納米抗體A11表達量較低外，納米抗體A5、A12、A23、A33和B1表達量均可占總蛋白30%，且有可溶性表達。選擇A5、A33進行表達純化，得到純度達90%的納米抗體。經Elisa檢測對瘦素有結合活性。